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1.1 分析超速离心法

最初的高速离心机主要用于研究细胞的“提取物”，这种应用和金属材料的限制〖意味着：样品的体积必须尽量小，于是设计了带透明窗的转头，以便在离心期间√测定离心池中颗粒的分布，有种特制的分析转头，它带有分析池，可注入待分析的样品。分析样品是均一¤的悬液，将转头加速到它的操作速度，样品◢颗粒按一定速度下沉，它们的大小、形状和离心力决定了它们¤的沉降速度。因此，如果分析样品◣是仅含一种颗粒的均一悬液，在分析池内由于颗粒不断沉降，一个清晰的界面将向池底慢慢移动。如果分析样品是一些颗粒的混合物，则每种颗粒将以它自己■的速度沉降。分析超速离心法在这个基本且简单的ξ基础上很快发展起来。

1.2 差速沉淀法

差速沉淀法在原理上与分析超离心机中的①分离一样：离心管注入均一的悬液，离心期间，颗粒移向离心管底部，并在底部♂沉淀。离心时间选择ㄨ到刚好足以使所有的最大颗粒都沉淀，这样得到没◥有这种颗粒的上清液，这个上清液可在更高的速度下离心，以分离第二大的颗粒，如此等等。缺点是沉淀将是不均一的，如果控制离心时间使∏最大颗粒刚好全部沉淀，会造成轻度混杂，更长时间的离心将会造Ψ成更多的混杂。

“洗”沉淀物可改进差速离心所取得的分离效果，将沉淀物在均匀的溶于介质中，按原来沉淀过程一样的※条件再离心，可使沉淀物中混有的大小差别很大的颗粒再次分离，混杂度大大〖降低，尽管如此，但还不能分↘离大小相近的颗粒。因此，如果需要得到更好的分辨力，则必须使用其它↙的一些技术。

1.3 速率区带离心法

速率区带离心法技术最初是由Brakke（1951）提出的，本质上这个技术是非【常简单的：将小量悬液放在一平缓的密度梯度液上，用此梯度液来稳定颗粒的沉降。由于离心，颗粒离开起始区】带而移动，移动的速度是由颗粒的大小、形状和它们所受到的离心力来决定的。离心一段时间后，各种颗粒将按它们的相对速度移动而各自分开成一系列区带。在这○种方法中，可毫不困难的分离沉降速度差←为20％或差别更小的颗粒，所以速率区↓带离心法扩大了差速沉淀法的分离范围。

和大多数技术一样，起先存在一些问题，使它在最初的十年中↑未能推广使用。速率区带离心法不能在角转头中进行，因为在转头加速期间样品会与梯╲度液混合，直到目前，甩开转头的容量还受到明显的限制。由于沉降区带的宽度和起始区带一样宽或宽于起始区带，如果要取得满意的分离，就要限制装到转头中的样品的□体积。此外，样品中物质的浓度不应¤太高，不然，整个带将︻与梯度顶部的溶液混合，尽管此技术介绍后不久，Thomson等人便用速率区带离心法去分离⌒　线粒体和溶酶体，但速率区带离心法最初主要用于分析分离，例如分析聚核糖体样品的□　大小，分布或RNA的大小、分布。甩开转头设计上的改□　进，特别是引入区带转头，大大扩展了速率区带离心法的■应用，这正是我们应用的主要方法，这个方法也可使用垂直转头。

1.4 等密度区带离心法

正如Harvy首先指出的那样，亚细胞颗粒不仅在大小上不同，而且密度也不同。将含有活细胞的悬液放到较细●胞密度更大的溶液上，由于离心，细胞在二液交≡界处成带。在显微镜下检查时，细胞的内含物似乎已分至若干层内，此分离尚不致杀死细胞，但如果增加离心的↘速度，细胞可分▲成两部分，核与较♂高密度的碎片在一起。再利用这两部分的密度差通过在有机溶剂中漂浮的方法可进一步纯化核。很久以后，才有通过在密的蔗糖溶液中沉降来纯化核的工作。

大多数早期的分离是将颗粒悬于选定密→度的液体中，离心后小于介质密度的颗粒悬浮，大于介质密度的颗粒沉淀。分段漂▂浮的分离方法既费时间又麻烦，特别是分离一种以上的颗粒时更是如此，因此后来的研究者建立了等密度梯度离心技术。将要分离的颗粒★悬液放至密度梯度液上，或者实际上将颗粒溶于制作梯度的溶液中，通过离心，颗粒或者上浮或者】下沉，到达与它们密度相同的液体处。在这里，它们没有重量，不管离心的时间多么长，它们再也不移动了。这些颗粒成为一系列的区带，每种颗粒在它自己的々密度区。

这项技〓术最初用于分析超速离心机，它没有速率区带离心法那么↘多的问题。1959年Beaufay等使用这项技术表明：在过氧化氢的合成和分解中有一组酶，在差速离心时与酶一  体沉降，而实际上它是结合在与溶酶体十分不同的微体颗粒上的（或过氧化物酶体〓上的）。

从那时♀以来，等密【度梯度离心法已广泛的应用于生物制品的分离，然而，与速率区◣带离心法相比，它有一个主要的缺点是等密度分离期间，颗粒不可避免◥的暴露在高浓度的梯度溶液中，这□可引起颗粒的损伤，并可能出现相当于损伤颗粒的一些格外的◢区带。

膜分离过程以选择性透过膜为分离介质，当膜两侧存在某种推动力（如压力差、浓度差、电位差等）时，原料╳侧组分选择性的透过膜，以达到分离目的。通常↑膜原料侧称膜上游，透过侧称膜下游。不同的膜过程使用的膜不同，推动力也不同。膜分离技术主要分为微滤，超滤，纳滤，反渗透。

“色谱法”这一术语是俄国化学家茨维特于1903年首创的。他在白旗柱上用石油醚为溶剂∩，将绿叶中的色素分成不◣同颜色的区带，顾命名为“色谱法”。其后Martin和Synge于1941年发表了液相分配色谱的论文，为液相色谱、气相色谱、纸色谱和薄层色谱的发展奠定了基础，为此他们获得了诺贝尔奖金。在我国于20世纪50年代后开展了这方面的工作，但所用名词不一致。化学工作者多喜用“色谱法”，而生化工作者多习☆惯于用“色层法”或“层析”。目前在我国有关这一类▲方法的名称尚未统一。

色谱法是用来分离混合物中各种组分的方法。色谱系统包括两相，固定相和流动相。当流动相流过加有样品的固定相时，由于各组分在两相之◆间的浓度比例不同，就会以不同速度移动而分离开来。固定相可以是固体①，也可以是被固体或凝胶支持的液体。固定相可以装入柱中，展成薄层或涂成薄膜，称为色谱“床”。流动相可以是气体，也可以是液体，前者称为气→相色谱，后者称∑为液相色谱。

3.1 凝胶过滤层析

又称排阻色谱、凝胶渗透、凝胶色谱、分子筛色＠谱等。是液相色谱技术中以分子大小分离的一项技术。主要应用于组分分离: 脱盐、更换々缓冲液、去除有害试剂，纯化蛋白、多肽、多糖等生物分子，计算分子大小及分子的同质性等。它具有快速更换缓冲液，温和、高产，任何缓冲ξ　系统，去除聚体，以大小分离等优点，但缺点是低选择性和上样量受限制。若要提高分辨率，则可选择检测柱效，检测分离度，减少上样体积，降低流速，使用更小的介质颗粒的介质，连接2根层◥析柱等方法。

3.2 离子∩交换层析

离子交换色谱法是一种吸附□色谱，是以分子的电荷差异来分离的。它以适用于所有的纯化阶段及所有的规模生产、可控制的、高选择、高载量、可以浓缩样品和高回收率等特点而广泛应用。此外，没有一种离子交换是非常完↘美的，选择正确的离子←交换介质至关重要，不同▓的样品、不同的纯化目的需要不同的离☆子交换介质。另外，值得注意的是在上样前对样品加以处理：去除颗粒物质（离心或过滤的方法），调整pH值及离子强度(使用脱盐或缓冲液交换》的方法)，上样体积没有限制，但蛋→白含量小于柱载量，注意核酸的影响（阴离子交换）。

3.3 疏水层析

疏水层析是液相色谱技术中按生物分子的疏水性质分离的一项技术，它是对离子▃交换技术，凝↓胶过滤技术，亲和层析技术的▅补充。具有温和，非变性条⌒件纯化；也是一种浓缩技术；具有高选择性，高收率ξ等特点。

3.4 亲和层析

亲和层析是通过生物分子〖之间特异性的相互作用ζ分离生物分子的一项技术。它是一门特别容易使用的方法，具有简单易『行，高纯度，浓缩样品等特点。更♀以纯化蛋白质尤为常见，因为它容易使用，一步纯化能使纯度大于95％，去除ζ　特异杂质，快速分离。广泛的应用于单克隆抗体◥和多克隆抗ζ　体的分离，融合蛋白的分离，酶的分离，DNA结合蛋白的分离，任何蛋白可以结合它的配体。

近年来，在传统和新型疫苗的制备中，应用先进的分离纯化技术是提高疫苗效力降低副反应的有效手段。目前广泛研发的病毒亚ξ单位疫苗、流脑多∮糖疫苗、流感嗜血杆菌结合疫苗和各类病毒的核酸(DNA)疫苗等，在研制方〓式、组成成分和物理、化学性质及原始来源等〓诸多方面都存在或大或小的差异，其ㄨ分离纯化方法具有相对特殊性。

针对不同的疫苗应选用不同的分离纯化路线，但一般而☉言，都包括两个基本阶段：初级分离和精制纯化。初级分离阶段〓的主要任务是分离细胞和培养液♂，破碎细胞释「放产物(如果产Ψ物在细胞内)，浓◥缩产物和去除大部分杂质等，这一阶段可选用的分离方法包括细胞破碎技术、离心沉降、盐析和超滤浓缩技术等；精制纯化阶㊣　段则选用各种具有高分辨率的技术↘，以使目的蛋白和少量干ぷ扰杂质尽可能分开，达到所需的质量标准，超速离心技▓术和各种层析技术成为当前达到此目的的主要方法。

从国内外新型疫苗和基因工程产品，在其分离纯化技术应用发展现状可╲以看出：

①膜分离和超〗速离心纯化技术在疫苗、蛋白组分、多肽及生物大分子的纯化过程中有╲着广阔的发展前景「。用该工艺制备』的疫苗，纯度和性状符合规程要求，但抗原回收率相〒对较低、操作繁琐且周期长、技术设备要求〓高，近年来已逐渐为日臻成熟的层析技术所代替，在基因工程＠ 疫苗的研制中尤为如此；

②层析分离技术在简化操№作、提高效率、节约能源及降低成本方▅面，显示出越来越强的优势。带有多功能配基的层析介质和全自动化的高效层析系卐统的推出，扩大了应用范■围，更便于标准化卐的实施。在众多层ζ析法中,亲和层析可能成为最有效的，从低浓度培养液中高效分离目的蛋白的纯化方法；

③用于传统疫苗和新型疫苗的纯化技术,必须依靠各学科相关技术之间的结合而∞发展起来的，至今尚无一项技术能单独承担︻分离纯化的全过程。创新的ω　分离纯化工艺，往往是由多项新技术和原有技术的优势组合而成。传统的离心、过滤和沉淀技术更〇多只是作为整个疫苗分离纯化工艺的起始步骤，用于』初步分离过程，层析技术与沉△淀、离心等传统分离技术的结合已逐渐成为疫苗分离纯化的主流。